公共场所集中空调系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法

　　冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法

　　本附录规定了集中空调通风系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中嗜肺军团菌的检验方法。

　　A1原理

　　待测水样经过滤膜或离心浓缩后，一部分样品经酸处理与热处理，以减少杂菌生长，一部分样品不作处理。将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养，生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。

　　A2 主要仪器设备

　　A2.1 平皿：90mm

　　A2.2 培养箱：35~37℃

　　A2.3 紫外灯：波长360±2nm

　　A2.4 滤膜滤器

　　A2.5 滤膜：孔径0.22～0.45µm

　　A2.6 蠕动泵

　　A2.7 离心机

　　A2.8 涡旋振荡器

　　A2.9 普通光学显微镜、荧光显微镜、体式镜

　　A2.10 水浴箱

　　A3 采样

　　A3.1 采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉积物与软泥需用广口瓶，容器均需螺口或磨口，用前灭菌。

　　A3.2 采样量：每个采样点依无菌操作取水样(或沉积物、软泥等样品)约200ml。

　　A3.3 中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。

　　A3.4 样品运输与贮存：样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。

　　A4 方法与步骤

　　A4.1 样品处理

　　A4.1.1 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。

　　A4.1.2 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22～0.45µm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。

　　A4.1.3 热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。

　　A4.1.4 酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。

　　A4.2 接种与培养：取A4.1.2洗脱样品、A4.1.3 热处理样品及A4.1.4 酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板。将接种平板静置于CO2培养箱中，温度为35~37℃，CO2浓度为2.5%。无CO2培养箱可采用烛缸培养法。观察到有培养物生成时，反转平板，孵育10天，注意保湿。

　　A4.3 观察结果：军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，需每天在体式镜上观察。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色;菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，有荧光。

　　A4.4 菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35~37℃培养2天，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。

　　A4.5嗜肺军团菌型别的确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶(-/弱+)，硝酸盐还原-，尿素酶-，明胶液化+，水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。

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